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技术简介：
本发明针对传统方法难以有效分离间叔丁基苯酚及其杂质的问题，通过优化流动相（0.01%磷酸水溶液）、梯度洗脱程序及检测波长（275nm），结合特定色谱柱参数，实现杂质与主峰的完全分离，提升分析速度与准确性，适用于纯度检测及杂质定量分析。
关键词：间叔丁基苯酚分离方法，高效液相色谱分析
本发明涉及分析，具体涉及间叔丁基苯酚及其类似物的液相色谱分离方法。
背景技术：
1、间叔丁基苯酚是合成杀螨剂乙螨唑的关键中间体，其纯度直接影响最终产品的质量。在工业合成过程中，通常采用苯酚与对叔丁基苯酚反应制备间叔丁基苯酚，但该反应会同时生成二叔丁基苯酚等副产物。乙螨唑合成工艺要求间叔丁基苯酚中对叔丁基苯酚异构体含量严格控制在0.5%以下，否则将影响药物效能。
2、间叔丁基苯酚及其合成过程中常见副产物及杂质的结构如下：
3、
4、现有技术中，常见的酚的异构体分离难度不大，而对间/对叔丁基苯酚异构体的分离分析主要依赖气相色谱法。然而，常规气相色谱柱对此异构体的分离度仅为0.8~1.0，无法满足精准定量要求。当分离度低于1.5时，低含量的对叔丁基苯酚因与主峰重叠形成肩峰，导致积分结果严重偏差，致使分析数据可靠性显著下降。目前有效的分离手段是采用专用酚类色谱柱（如kb cresol柱），其需满足60 m柱长及1.0μm膜厚的特定条件才能实现分离度1.5。但该方法分析周期长达1小时/样，效率低下，难以满足生产过程中对异构体含量的实时监控需求。
5、因此，开发一种快速、高精度分离检测间/对叔丁基苯酚异构体的分析方法，对提升乙螨唑中间体质量控制水平及对于乙螨唑产品品质的提升尤为重要。具有重要意义。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供间、对叔丁基苯酚及二叔丁基苯酚异构体的液相色谱分离方法。该方法可以实现各异构体分离，实现很好的定性与定量分析，有利于产品的质量控制。
2、本发明提供了间叔丁基苯酚及其类似物的液相色谱分离方法，用高效液相色谱对测试品进行检测，色谱条件包括：
3、色谱柱为c18键合带电荷杂化五氟苯基柱；
4、流动相a为质量分数0%~0.1％的磷酸水溶液；
5、流动相b为甲醇；
6、洗脱方式为梯度洗脱。
7、本发明中，所述液相色谱分离方法用于分离混合物中的间叔丁基苯酚及其类似物。
8、一些实施例中，所述类似物包括苯酚、对叔丁基苯酚、3,5-二叔丁基苯酚、2,4-二叔丁基苯酚和2,6-二叔丁基苯酚中的至少一种；可选的，所述类似物包括苯酚、对叔丁基苯酚、3,5-二叔丁基苯酚、2,4-二叔丁基苯酚和2,6-二叔丁基苯酚。
9、一些实施例中，所述液相色谱分离方法用于分离间叔丁基苯酚与间叔丁基苯酚类似物，所述间叔丁基苯酚类似物包括苯酚、对叔丁基苯酚、3,5-二叔丁基苯酚、2,4-二叔丁基苯酚和2,6-二叔丁基苯酚中的至少一种。
10、一些实施例中，所述液相色谱分离方法用于分离（间叔丁基苯酚和对叔丁基苯酚）与间叔丁基苯酚的其他类似物，所述类似物包括苯酚、3,5-二叔丁基苯酚、2,4-二叔丁基苯酚和2,6-二叔丁基苯酚中的至少一种。
11、一些实施例中，所述液相色谱分离方法用于分离（间叔丁基苯酚、对叔丁基苯酚和苯酚）与间叔丁基苯酚的其他类似物，所述类似物包括3,5-二叔丁基苯酚、2,4-二叔丁基苯酚和2,6-二叔丁基苯酚中的至少一种。
12、一些实施例中，所述流动相a为质量分数0%~0.1％的磷酸水溶液。例如，所述流动相a为纯水、0.01%磷酸水溶液、0.05%磷酸水溶液或0.1%磷酸水溶液。
13、一些实施例中，所述流动相a为质量分数0.01%~0.05%的磷酸水溶液。例如，所述流动相a为0.01%磷酸水溶液、0.02%磷酸水溶液、0.03%磷酸水溶液、0.04%磷酸水溶液或0.05%磷酸水溶液；优选的，所述流动相a为质量分数0.01％的磷酸水溶液。
14、本发明所述液相色谱分离方法可实现上述各组分的有效分离，且各色谱峰之间具有良好分离效果。一些实施例中，所述间叔丁基苯酚及其类似物的分离度不低于1。优选的，所述间叔丁基苯酚及其类似物的分离度不低于1.5。更优选的，所述间叔丁基苯酚及其类似物的分离度不低于2。具体的，所述间叔丁基苯酚及其类似物的分离度为2.02。
15、一些实施例中，在相同流动相b、相同梯度洗脱程序的条件下，不同流动相a对间、对叔丁基苯酚的分离效果具有显著影响：
16、当流动相a为纯水时，间、对叔丁基苯酚的分离度为1.5；
17、当流动相a为0.1%磷酸水溶液时，分离度为1.46；
18、当流动相a为0.05%磷酸水溶液时，分离度为1.51；
19、而当流动相a为0.01%磷酸水溶液时，分离度提高至2.02。
20、上述结果表明，使用质量分数0.01％的磷酸水溶液作为流动相a时，可获得最优分离效果，显著改善目标化合物的色谱行为，提高分离效率与检测准确性，从而有利于实现更可靠的分析定量结果。
21、本发明中，所述洗脱方式可采用梯度洗脱。
22、一些实施例中，所述梯度洗脱的条件为甲醇体积分数在0~12min以0~2.3%/min的速率增加。例如，甲醇体积分数以0.5%/min 、1%/min、1.5%/min、2%/min或2.3%/min的速率增加。优选的，甲醇体积分数以1%/min的速率从35%增加至45%。
23、一些实施例中，所述梯度洗脱的程序为：
24、0~10min，a相：65%~55%、b相：35%~45%；
25、10~14min，a相：55%~10%、b相：45%~90%；
26、14~17min，a相：10%、b相：90%；
27、17~18min，a相：10%~65%、b相：90%~35%；
28、18~22min，a相：65%、b相：35%。
29、一些实施例中，当流动相a为0.01%磷酸水溶液时，不同的流动相梯度（控制流动相b占总流动相的体积分数），对间、对叔丁基苯酚的分离效果具有显著影响：
30、（1）1~12min的洗脱程序中，甲醇体积分数以2.27%/min的速率从40%增加至65%，分离度为1.54；
31、（2）0~12min的洗脱程序中，甲醇体积分数以1.25%/min的速率从50%增加至65%，分离度为1.60；
32、（3）0~12min的洗脱程序中，甲醇体积分数以0.83%/min的速率从55%增加至65%，分离度为1.42；
33、（4）1~10min的洗脱程序中，甲醇体积分数采用恒定的55%甲醇洗脱，分离度为1.55；
34、（5）0~10min的洗脱程序中，甲醇体积分数以1%/min的速率从35%增加至45%，分离度提高至2.02。
35、上述结果表明，0~10min的洗脱程序中，流动相b——甲醇体积分数以1%/min的速率从35%增加至45%时，分离效果最佳，可实现杂质峰与主峰的完全分离。该方法分析速度快，灵敏度和准确度高，操作简便，有利于产品的质量控制。
36、本发明可选用的色谱柱填料包括但不限于：纯硅胶不封端的c18填料、全多孔的核壳c18填料、五氟苯基键合硅胶的c18填料、多孔石墨化碳色谱柱或c18键合带电荷杂化五氟苯基柱等，优选为表面带电荷的杂化的五氟苯基色谱柱。
37、相应的，可选用的色谱柱包括但不限于：月旭ultimate lp色谱柱、agilentproshell ec-120 c18色谱柱、月旭ultimate® pfp色谱柱、thermo-fisher石墨碳色谱柱hypercarb或微纯（微纯生物科技（广州）有限公司）phs xp-f5色谱柱（micropulite® phsxp f5色谱柱）等。
38、一些实施例中，所述色谱柱为c18键合带电荷杂化五氟苯基柱。优选的，所述色谱柱为微纯公司的phs xp-f5型号色谱柱，规格为4.6×150mm，粒径为3.5μm。
39、一些实施例中，所述色谱柱的柱温为25~45℃。例如，所述色谱柱的柱温为25℃、30℃、35℃、40℃或45℃。优选的，所述色谱柱的柱温为35℃。
40、一些实施例中，所述流动相a和流动相b的总流速为0.8~1.2ml/min。例如，所述流动相a和流动相b的总流速为0.8 ml/min、1 ml/min或1.2ml/min。优选的，所述流动相a和流动相b的总流速为1ml/min。
41、一些实施例中，所述液相色谱分离方法的进样体积为5~15μl。例如，所述进样体积为5μl、8μl、10μl、13μl或15μl。优选的，所述液相色谱分离方法的进样体积为5μl。
42、一些实施例中，所述液相色谱分离方法的检测器为1260四元低压泵配vwd紫外检测器；所述液相色谱分离方法的检测波长为220~275nm。例如，所述检测波长为220nm、225nm、230nm、235nm、240nm、245nm、250nm、255nm、260nm、265nm、270nm或275nm。具体的，所述检测波长为260~275nm，经全波长扫描分析，间、对叔丁基苯酚在此波长区间内呈现较大吸收峰。优选的，所述检测波长为275nm，以减少本底干扰，同时间、对叔丁基苯酚可以实现等质量比例响应。
43、一些实施例中，所述液相色谱分离中，间叔丁基苯酚及其类似物的洗脱顺序依次为苯酚、间叔丁基苯酚、对叔丁基苯酚、3,5-二叔丁基苯酚、2,4-二叔丁基苯酚和2,6-二叔丁基苯酚。
44、一些实施例中，所述测试品是以苯酚和对叔丁基苯酚为原料制备的间叔丁基苯酚的反应液；其制备方法参见文献美国专利us4103096、us3014079a等。
45、一些实施例中，所述测试品的前处理包括溶解和定容的步骤。
46、一些实施例中，所述测试品采用甲醇溶解，所述测试品的体积与甲醇的体积比为1：（150~250）；例如，所述测试品的体积与甲醇的体积比为1：150、1：200或1：250；具体的，所述测试品的体积与甲醇的体积比为1：200。
47、一些实施例中，所述间叔丁基苯酚及其类似物溶液中溶剂为甲醇，间叔丁基苯酚及其类似物的浓度为0.5~1.5mg/ml。例如，所述间叔丁基苯酚及其类似物的浓度为0.5、1.0或1.5mg/ml。具体的，所述间叔丁基苯酚及其类似物的浓度为1.0mg/ml。
48、一些实施例中，所述液相色谱分离中，数据的分析采用面积归一化法，控制对叔丁基苯酚杂质的相对比例小于1%，并同时监测各类二叔丁基苯酚异构体的比例。
49、本发明所述的分离方法，还包括标品配制和标曲定量的步骤，具体为：
50、将间叔丁基苯酚及其类似物用甲醇溶解至浓度为0.5~1.5mg/ml，得到标准品溶液；
51、将所述标准品溶液和测试品溶液分别采用高效液相色谱法测定，得到标准品色谱图和测试品色谱图；
52、根据所述标准品色谱图对测试品的成分进行定性；
53、以间叔丁基苯酚及其类似物的标准品进行检测，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程；
54、在相同的条件下，将待测品注入高效液相色谱，得到样品中各目标物的峰面积，代入回归方程，计算得到各目标物的含量。
55、本发明中，所述苯酚对照品的进样浓度范围在3~60μg/ml时，线性关系为y＝6.4013x-0.7508，r2＝0.9997。
56、所述间叔丁基苯酚对照品的进样浓度范围在100~2000μg/ml时，线性关系为y＝4.5953x+4.5498，r2＝1。
57、所述对叔丁基苯酚对照品的进样浓度范围在3~60μg/ml时，线性关系为y＝5.5517x-1.1674，r2＝0.9998。
58、所述3,5-二叔丁基苯酚对照品的进样浓度范围在2~50μg/ml时，线性关系为y＝4.1117x-0.1129，r2＝1。
59、所述2,4-二叔丁基苯酚对照品的进样浓度范围在3~50μg/ml时，线性关系为y＝4.0383x-0.5446，r2＝1。
60、所述2,6-二叔丁基苯酚对照品的进样浓度范围在3~55μg/ml时，线性关系为y＝3.098x-0.149，r2＝0.9999。
61、进一步的，本发明还提供了所述液相色谱分离方法在分离混合物中的间叔丁基苯酚及其类似物中的应用。
62、一些实施例中，所述应用包括：
63、混合物中，间叔丁基苯酚及其类似物的分离与定性和/或定量分析；
64、间叔丁基苯酚的纯度与杂质含量检测。
65、本发明提供的高效液相色谱分析方法，能有效的洗脱、分离和定量检测间叔丁基苯酚其杂质，使杂质峰与主峰完全分离，专属性好，分析速度快，灵敏度和准确度高。本发明提供的高效液相色谱分析方法可对间叔丁基苯酚进行快速、简单、可靠的含量测定和杂质含量测定。
技术特征：
1.间叔丁基苯酚及其类似物的液相色谱分离方法，其特征在于，用高效液相色谱对测试品进行检测，色谱条件包括：
2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述类似物包括苯酚、对叔丁基苯酚、3,5-二叔丁基苯酚、2,4-二叔丁基苯酚和2,6-二叔丁基苯酚中的至少一种；可选的，所述类似物包括苯酚、对叔丁基苯酚、3,5-二叔丁基苯酚、2,4-二叔丁基苯酚和2,6-二叔丁基苯酚。
3.根据权利要求1或2所述的分离方法，其特征在于，所述流动相a为质量分数0.01%~0.05%的磷酸水溶液；优选的，所述流动相a为质量分数0.01％的磷酸水溶液。
4.根据权利要求1~3任一项所述的分离方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序为：
5.根据权利要求1~4任一项所述的分离方法，其特征在于，所述色谱柱为微纯公司的phs xp-f5型号色谱柱，规格为4.6×150mm，粒径为3.5μm；
6.根据权利要求1~5任一项所述的分离方法，其特征在于，所述流动相a和流动相b的总流速为0.8~1.2ml/min；优选的，所述流动相a和流动相b的总流速为1ml/min；
7.根据权利要求1~6任一项所述的分离方法，其特征在于，所述液相色谱分离方法的检测器为紫外检测器；
8.根据权利要求1~7任一项所述的分离方法，其特征在于，所述测试品的前处理包括溶解和定容的步骤，所述测试品采用甲醇溶解，所述测试品的体积与甲醇的体积比为1：（150~250）；
9.根据权利要求1~8任一项所述的分离方法，其特征在于，还包括：
10.权利要求1~9任一项所述的液相色谱分离方法在分离混合物中的间叔丁基苯酚及其类似物中的应用。
技术总结
本发明涉及分析技术领域，具体涉及间叔丁基苯酚及其类似物的液相色谱分离方法。本发明提供的高效液相色谱分析方法，能有效的洗脱、分离和定量检测间叔丁基苯酚其杂质，使杂质峰与主峰完全分离，专属性好，分析速度快，灵敏度和准确度高。
技术研发人员：秦欣,严京武,邹悦,吴承骏,毛春晖
受保护的技术使用者：永农生物科学有限公司
技术研发日：
技术公布日：2025/12/18
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